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丙二醛含量試劑盒說明書(分光光度法)

貨號：LE-1-157

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

氧自由基作用于脂質(zhì)的不飽和脂肪酸，生成過氧化脂質(zhì)；后者逐漸分解為一系列復雜的化合物，其中 包括 MDA 。通過檢測 MDA 的水平即可檢測脂質(zhì)氧化的水平。

測定原理：

MDA 與硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)縮合，生成紅色產(chǎn)物，在 532nm 有最大吸收峰，進行 比色后可估測樣品中過氧化脂質(zhì)的含量； 同時測定 600nm 下的吸光度，利用 532nm 與 600nm 下的吸光度 的差值計算MDA 的含量。

試劑的組成和配置：

提取液：液體 60mL×1 瓶，RT，避光；

試劑一：液體 40mL×1 瓶，RT，避光；

試劑二：粉劑 1 瓶×2，4℃ 避光保存；

工作液配制：臨用前取 1 瓶試劑二加入 20mL 試劑一 ，溶解混勻，4℃保存一周 。工作液較難溶解， 可以 70℃-90℃加熱，并劇烈振蕩以促進溶解，或者通過超聲處理以促進溶解。

注意事項：

臨用前注意試劑一是否完全溶解，如未溶解，可以 70℃-90℃加熱，并振蕩以促進溶解。

需自備儀器和用品：

可見分光光度 、水浴鍋 、 臺式離心機 、可調(diào)式移液器 、 1ml 玻璃比色皿 、研缽 、冰和蒸餾水。

MDA 提?。?/span>

細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（ 10⁴ 個）：提取液體積（ml）為 500~ 1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1ml 提取液），超聲波破碎細菌或 細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰 上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（ g） ：提取液體積(ml)為 1 ：5~ 10 的比例（建議稱取約 0. 1g 組織，加入 1ml 提 取液） ，進行冰浴勻漿 。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

血清（漿）樣品：按照血清（漿）：提取液體積(ml)為 1 ：1 的比例，充分混合 。8000g 4℃離心 10min， 取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、吸取 0.5ml  試劑一于 2ml 離心管中，再加入 0.5ml 樣本,  混勻。

2、95℃水浴中保溫 30min（蓋緊，防止水分散失） ，置于冰浴中冷卻， 10000g，25℃, 離心 10min。

3、吸取 1ml 上清液于 1ml 玻璃比色皿中，測定 532nm 和 600nm 處的吸光度，記為A532 和 A600，ΔA= A532-A600。

MDA 含量計算

1、血清（漿） 中 MDA 含量的計算：

MDA 含量(nmol/ ml)=2×[ ΔA÷(ε×d)]×V 反總÷V 樣=25.8×ΔA

2、細菌 、細胞或動物組織中MDA 含量計算

（1）按照蛋白濃度計算

MDA 含量(nmol/ mg prot)=[ ΔA÷(ε×d)]×(V 反總÷V 樣)÷Cpr=12.9× ΔA ÷Cpr

需要另外測定，建議使用本公司BCA 蛋白質(zhì)含量測定試劑盒。

（2）按照樣品質(zhì)量計算

MDA 含量(nmol/g  鮮重)=[ ΔA÷(ε×d)]×(V 反總÷V 樣)×V 樣總÷W= 12.9 ×ΔA ÷W

（3）按照細菌或細胞密度計算：

MDA 含量(nmol/10⁴)=[ ΔA÷(ε×d)]×(V 反總÷V 樣)÷(500÷V 樣總)=0.0258×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，1 ml；ε：丙二醛摩爾消光系數(shù)，155×10-3 L / μmol /cm；d： 比色皿光徑，  1cm；V 樣：加入樣本體積，0.5 ml；V 樣總：加入提取液體積，1ml；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W： 樣本質(zhì)量，g；500：細胞或細菌總數(shù)，500 萬。